RT-PCR панел в реално време за откриване 2019-nCoV

2023 Автор: Stephanie Arnold | [email protected]. Последно модифициран: 2023-05-20 19:52

Инструкции за употреба

Икона за версия на принтера pdf икона [PDF]

Съдържание

• Въведение
• Пробите
• Реактиви, консумативи и изисквания към оборудването
• Екстракция на нуклеинова киселина
• Контрол на качеството
• rRT-PCR тестове
• Тълкуване на резултатите от теста
• Ограничения за анализ
• Информация за връзка

Въведение

Предназначение: Този документ описва използването на RT PCR тестове в реално време (rRT-PCR) за in vitro качествено откриване на коронавирус за новородени 2019 г. (2019-nCoV) в дихателни проби и серуми. Комплектите праймери и сонда 2019-nCoV са проектирани за универсално откриване на коронавируси, подобни на SARS (N3 анализ) и за специфично откриване на 2019-nCoV (N1 и N2 тестове).

Ограничения за използване на протокола: Описаните тук rRT-PCR анализи не са валидирани за платформи или химикали, различни от описаните в този документ.

Пробите

Предпазни мерки за биологична безопасност

Носете подходящи лични предпазни средства (напр. Рокли, ръкавици, защита на очите), когато работите с клинични образци. Обработката на пробата трябва да се извърши в сертифициран кабинет за биологична безопасност клас II, като се спазват указанията за ниво на биобезопасност 2 или по-високи. За повече информация вижте:

• Междинни насоки за събиране, боравене и тестване на клинични образци от лица, които са в разследване (PUI) за новия коронавирус за 2019 г. (2019-nCoV) https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html
• Биобезопасността в микробиологични и биомедицински лаборатории 5 ^-то издание на разположение на

Приемливи екземпляри

• Респираторни проби, включително: назофарингеални или орофарингеални аспирати или промивки, назофарингеални или орофарингеални тампони, бронхоалвеоларни промивки, аспирати на трахеята и храчки.

  Пробите от натривки трябва да се събират само върху тампони със синтетичен връх (като полиестер или Dacron®) с алуминиеви или пластмасови валове. Размивки с калциев алгинат или връх от памук с дървени шахти не са приемливи

Обработка и съхранение на екземпляри

• Пробите могат да се съхраняват при 4 ^o C до 72 часа след събирането.
• Ако се очаква забавяне на екстракцията, съхранявайте пробите при температура -70 ^o C или по-ниска.
• Екстрахираните нуклеинови киселини трябва да се съхраняват при -70 ^o C или по-ниски.

Критерии за отхвърляне на образеца:

• Пробите не се съхраняват при 2-4 ° C (≤4 дни) или се замразяват при -70 ° C или по-ниски.
• Непълно етикетиране или документация на образеца.
• Неподходящ тип екземпляр.
• Недостатъчен обем на пробата.

Реактиви, консумативи и изисквания към оборудването

Отказ от отговорност: Имената на доставчици или производители се предоставят като примери за подходящи източници на продукти. Включването не означава одобрение от Центровете за контрол и превенция на заболяванията.

Реактиви и консумативи

• rRT-PCR комплекти грунд / сонда
• Положителен контрол на шаблона
• TaqPath ™ 1-стъпка RT-qPCR Master Mix, CG (ThermoFisher; cat # A15299 или A15300)
• Вода с молекулен клас, без нуклеини
• Ръкавици без прах за еднократна употреба
• P2 / P10, P200 и P1000 аерозолна бариера
• Стерилни безцентрични 1.5 ml епруветки за микроцентрифуга
• 0.2 mL PCR реакционни епруветки или 96-ямкови PCR реакционни плочи в реално време и оптични ленти с 8-капачка
• Писалка за лабораторна маркировка
• Охладителни стелажи за 1.5 микроцентрифужни епруветки и 96-ямкови 0.2 mL PCR реакционни епруветки
• Стелажи за 1, 5 ml епруветки за микроцентрифуга

• Приемливи повърхностни дезактиванти

  • DNAZap ^TM (Life Technologies, кат. # AM9890)
  • DNA Away ^TM (Fisher Scientific; кат. № 21-236-28)
  • RNAse Away ^TM (Fisher Scientific; кат. № 21-236-21
  • 10% белина (1:10 разреждане на търговски 5, 25-6, 0% натриев хипохлорит)

оборудване

• PCR Work Station [UV лампа; Ламинарен поток (клас 100 HEPA филтриран)]
• Вортекс миксер
• Микроцентрофуга
• Микропипети (2 или 10 µl, 200 µl и 1000 µl)
• Многоканални микропипети (5-50 µl)
• 2 х 96-ямкови студени блокове
• -20 ^o C (без замръзване) и -70 ^o C фризери; 4 ^o C хладилник
• Система за откриване на PCR в реално време
• Система за извличане на нуклеинова киселина

Екстракция на нуклеинова киселина

• Ефективността на тестовете, базирани на амплификация на rRT-PCR, зависи от количеството и качеството на РНК шаблон на пробата. Процедурите за извличане на РНК трябва да бъдат квалифицирани и валидирани за възстановяване и чистота преди тестване на проби.
• Предлаганите в търговската мрежа процедури за екстракция, за които е доказано, че генерират високо пречистена РНК, когато следват препоръчаните от производителя процедури за извличане на проби, включват: биоМерие NucliSens® системи, QIAamp® Viral RNA Mini Kit, QIAamp® MinElute Virus Spin Kit или RNeasy® Mini Kit (QIAGEN), EZ1 DSP комплект за вируси (QIAGEN), комплект за изолация на РНК от Roche MagNA Pure Compact, комплект за изолация на нуклеинова киселина от Roche MagNA Pure и комплект с малки ДНК на Roche MagNA Pure 96 и вирус на НА и Invitrogen ChargeSwitch® Total RNA Cell Kit.
• Задържайте остатъчния образец и нуклеиновия екстракт и съхранявайте веднага при -70 ^o C
• Размразявайте само броя екстракти от проби, които ще бъдат тествани за един ден. Не замразявайте / размразявайте екстрактите повече от веднъж преди тестване.

Контрол на качеството

Поради чувствителността на rRT-PCR, тези анализи трябва да се провеждат при използване на строг контрол на качеството и процедури за осигуряване на качеството. Следването на тези указания ще помогне да се сведе до минимум вероятността от фалшиво положително усилване.

Общи съображения

• Персоналът трябва да е запознат с използвания протокол и инструменти.
• Поддържайте отделни зони и специално оборудване (напр. Пипети, микроцентрифуги) и консумативи (напр. Микроцентрифужни тръби, накрайници за пипети, рокли и ръкавици) за настройка на реагентите за анализ и работа с извлечени нуклеинови киселини.
• Работният поток винаги трябва да е от чистата до мръсната зона.
• Носете чисти рокли за еднократна употреба и нови, преди това неподправени, без прах ръкавици по време на настройка на реагента за анализ и работа с извлечени нуклеинови киселини. Сменяйте ръкавиците, когато се подозира замърсяване.
• Съхранявайте грунд / сонди и главна смес от ензими при подходящи температури (вижте опаковъчните вложки). Не използвайте реагенти след срока на годност.
• Съхранявайте епруветките с реагентите и максимално затворените реакции.
• Почистете и обеззаражете повърхностите.
• Не въвеждайте извлечена нуклеинова киселина или PCR продукти в зоната за настройка на анализа.
• Използвайте само аерозолни бариери (филтърни) пипети.
• Използвайте само капачките на PCR плочи. Не използвайте PCR плоско уплътняващо фолио.

Тестове за контрол

• Контролите за анализ трябва да се изпълняват едновременно с всички тестови проби.
• PTC - положителен шаблон за управление с очакван диапазон на стойност на Ct
• NTC - добавен е отрицателен шаблон за контрол по време на настройка на реакцията rRT-PCR
• HSC - контрол на екстракцията на човешки екземпляр, екстрахиран едновременно с тестовите проби; осигурява процедурен контрол за извличане на нуклеинова киселина и вторичен отрицателен контрол, който потвърждава процедурата за екстракция на нуклеинова киселина и целостта на реагента
• RP - всички клинични проби трябва да бъдат тествани за човешки РНКаза Р (RNP) ген, за да се оцени качеството на пробата
• Забележка: Продължавайте да поддържате дневници на PTC ефективността. След всеки цикъл на rRT-PCR на клинични проби, контролните стойности на Ct трябва да бъдат записани.

rRT-PCR тестове

Подготовка на запасите

rRT-PCR Грундове / набори за сонда (вижте вмъкването на пакета, ако е осигурено от CDC)

• Предпазни мерки: С тези реактиви трябва да се борави само в чист район и да се съхраняват при подходящи температури (виж по-долу) на тъмно. Циклите на замръзване-размразяване трябва да се избягват. Поддържайте студ при размразяване.
• Използвайки асептична техника, суспендирайте изсушените реагенти в 1, 5 ml вода без нуклеаза и оставете да се рехидратира в продължение на 15 минути при стайна температура на тъмно.
• Смесете внимателно и аликвотни грундове / сонда в 300 μL обеми в 5 предварително етикетирани епруветки. Съхранявайте единична аликвота от грундове / сонда при 2-8 ^o C на тъмно. Да не се замразява отново (стабилен до 4 месеца). Съхранявайте останалите аликвоти при ≤ -20 ^o C във фризер без замръзване.

Положителен контрол на шаблона (PTC) (ако използвате CDC положително управление, nCoVPC, вижте пакета, предоставен от CDC)

• Предпазни мерки: Този реагент трябва да се работи с повишено внимание в специална зона за обработка с нуклеинова киселина, за да се предотврати възможно замърсяване. Циклите на замръзване-размразяване трябва да се избягват. Поддържайте на лед при размразяване.
• Използва се за оценка на ефективността на rRT-PCR тестове. Ресуспендирайте изсушения реагент във всяка епруветка в 1 mL вода без нуклеаза, за да се постигне правилната концентрация. Използвайте аликвоти за еднократна употреба (приблизително 30 μL) и съхранявайте при ≤ -70 ° C.
• Размразете единична аликвота от разредена положителна контрола за всеки експеримент и задръжте върху лед, докато се добави към плаката. Изхвърлете неизползваната част от аликвотата.
• NCoVPC съдържа също човешка ДНК, която служи като положителна контрола за RP анализа.

Подготовка на оборудването

1. Почистете и обеззаразите всички работни повърхности, тръби, центрофуги и друго оборудване преди употреба, като използвате RNase Away ^® или 10% прясно приготвен белина.
2. Включете AB 7500 Fast DX и оставете блока да достигне оптимална температура.
3. Извършете настройка на табелата и изберете цикличния протокол на инструмента.
4. Настройки на инструмента: детектор (FAM); Гасител (няма); Пасивна справка: (няма); Режим на изпълнение: (Стандартен); Обем на пробата (20 µL)

Подготовка на оборудването

стъпка	цикли	Темп	път
Инкубация на УНГ	1	25 ° С	2 мин
RT инкубация	1	50 ° С	15 мин
Ензимно активиране	1	95 ° С	2 мин
усилване	45	95 ° С	3 сек
		55 ° С	30 сек

* Данните за флуоресценция (FAM) трябва да се събират по време на етапа на инкубация при 55 ° C.

Реакционен главен микс и настройка на плочи

Забележка: Конфигурацията за настройка на плочи може да варира в зависимост от броя на екземплярите и организацията на работния ден. NTC и nCoVPC трябва да бъдат включени във всяко изпълнение.

1. В помещението за почистване на реагента почистете капака на r4X Master Mix и грунда / сондата върху лед или студен блок. Дръжте на студено по време на подготовка и употреба.
2. Размразяване 4X реакционна смес преди употреба.
3. Смесете 4X Master Mix и грунд / сонди чрез инверсия 5 пъти.
4. Накратко центрофугирайте 4X Master Mix и грундове / сонди и се върнете към студен блок.
5. Етикетирайте една 1, 5 ml микроцентрифужна епруветка за всеки грунд / сонда.

6. Определете броя на реакциите (N) за установяване на един анализ. Необходимо е да се направи излишна реакционна смес за реакциите NTC, nCoVPC и RP и за грешка при пипетиране. Използвайте следното ръководство, за да определите N:

   • Ако броят на пробите (n), включително контролите, е равен на 1 до 14, тогава N = n + 1
   • Ако броят на пробите (n), включително контролите, е 15 или по-голям, тогава N = n + 2
7. За всеки комплект грунд / сонда, изчислете количеството на всеки реагент, който трябва да се добави за всяка реакционна смес (N = # от реакциите).

TaqPath ™ 1-стъпка RT-qPCR Master Mix

TaqPath ™ 1-стъпка RT-qPCR Master Mix

Стъпка №	реагент	Vol. на реагент добавен на реакция
1	Вода без нуклеини	N x 8, 5 uL
2	Комбинирана смес за грунд / сонда	N x 1, 5 uL
3	TaqPathTM 1-стъпка RT-qPCR Master Mix (4x)	N x 5.0 uL
	Общ обем	N x 15.0 uL

1. Разпределете реагентите във всяка съответна етикетирана 1, 5 ml епруветка за микроцентрифуга. След добавяне на реагентите смесете реакционните смеси чрез пипетиране нагоре и надолу. Не завихряйте.
2. Центрофугирайте в продължение на 5 секунди, за да съберете съдържание в долната част на епруветката, и след това поставете епруветката в студен шкаф.
3. Поставете епруветки или плочи с реакционни ленти в стелаж с 96-ямкови охладители.
4. Разпределете 15 µL от всяка главна смес в съответните кладенци, минаващи през реда, както е показано по-долу (Фигура 1):

Фигура 1: Пример за настройка на плаки с миксер на реакцията

1. Преди да преминете към зоната за обработка на нуклеиновите киселини, подгответе реакциите без контролен шаблон (NTC) за колона №1 в зоната за подготовка на анализа.
2. Пипетирайте 5 мкл вода без нуклеаза в ямките за проби NTC. Сигурно затворете NTC кладенци, преди да продължите.
3. Покрийте цялата реакционна плака и преместете реакционната плоча в зоната за обработка на нуклеиновата киселина.

Добавяне на шаблон

1. Внимателно завихрете епруветки с проба от нуклеинова киселина за приблизително 5 секунди.
2. След центрофугиране поставете извлечените епруветки с нуклеинова киселина в студения шкаф.
3. Пробите трябва да се добавят в колона 2-11 (колони 1 и 12 са за контроли) към специфичния анализ, който се тества, както е показано на фигура 2. Внимателно пипетирайте 5, 0 µL от първата проба във всички гнезда, маркирани за тази проба (т.е. проба „S1“надолу в колона № 2). Дръжте други кладенци с проби по време на добавяне. Променяйте съветите след всяко добавяне.
4. Силно запечатайте колоната, към която е добавена пробата, за да се предотврати кръстосано замърсяване и да се гарантира проследяване на пробата.
5. Сменяйте ръкавиците често и когато е необходимо, за да избегнете замърсяване.
6. Повторете стъпки №3 и №4 за останалите проби.
7. Ако е необходимо, добавете 5 uL проба от извлечена от човешкия проба (HSC) в ямките HSC (фигура 2, колона 11). Сигурно затваряйте кладенци след добавяне
8. Покрийте цялата реакционна плака и преместете реакционната плоча в зоната за обработка с положителен шаблон за контрол.

Допълнение за анализ на контрола

1. Отпипетирайте 5 ul от nCoVPC РНК в ямките за пробата на колона 12 (фигура 2). Сигурно се затварят ямки след добавяне на контролната РНК.

   ЗАБЕЛЕЖКА: Ако използвате ленти с 8 тръби, маркирайте ТАБ на всяка лента, за да посочите позицията на пробата. НЕ ЕТИКЕТЕТЕ ВРЪЩИТЕ НА РЕАКЦИОННИТЕ ТРАБИ!

2. Накратко центрофужната реакционна епруветка се отстранява за 10-15 секунди. След центрофугиране се връща в студена поставка.

   ЗАБЕЛЕЖКА: Ако използвате 96-ямкови плаки, центрофугирайте плаки за 30 секунди при 500 xg, 4 ° C.

Фигура 2. 2019-nCoV rRT-PCR диагностичен панел: Пример за настройка на проби и контрол

^a Заменете пробата в тази колона с извлечена HSC, ако е необходимо

Анализ на данни

След приключване на изпълнението запазете и анализирайте данните, следвайки инструкциите на производителя на инструмента. Анализите трябва да се извършват отделно за всяка цел, като се използва ръчна настройка на прага. Праговете трябва да се регулират така, че да попаднат в експоненциална фаза на флуоресцентните криви и над всеки фонов сигнал (вижте фигура 3). Избраната процедура за определяне на прага трябва да се използва последователно

Фигура 3. Прозорец за усилване

Тълкуване на резултатите от теста

• НТК трябва да са отрицателни и да не показват криви на растеж на флуоресценция, които пресичат праговата линия.

  • Ако възникне фалшив положителен резултат с един или повече реакции на грунд и сонда NTC, може да се случи замърсяване на пробата.

    Невалиден цикъл и повторете анализа с по-строго спазване на указанията за процедурата

• PTC реакцията трябва да доведе до положителен резултат с очаквана стойност на Ct за всяка цел, включена в теста.

  • Ако не се постигне очаквана положителна реактивност, обезсилване на цикъл и повторение на анализа с по-строго спазване на указанията на процедурата.
  • Определете причината за неуспешната реактивност на PTC, въведете коригиращи действия и документирайте резултатите от разследването и коригиращите действия.
  • Не използвайте PTC реагенти, които не генерират очакван резултат.

• RP трябва да бъде положителен на или преди 35 цикъла за всички клинични проби и HSC, като по този начин показва наличието на достатъчно нуклеинова киселина от човешкия RNase P ген и че пробата е с приемливо качество.

  • Ако не открие RNase P в HSC може да показва:

    • Неправилна настройка и изпълнение на анализа
    • Неизправност на реагента или оборудването

  • Откриването на RNase P в HSC, но неуспехът на откриване на RNase P в която и да е от клиничните проби може да показва:

    • Неправилно извличане на нуклеинова киселина от клинични материали, което води до загуба на нуклеинова киселина или пренасяне на PCR инхибитори от клинични проби
    • Липса на достатъчно човешки клетъчен материал в пробата, която да позволи откриването

• HSC трябва да бъде отрицателен за специфични комплекти грунд / сонда за 2019-nCoV.

  • Ако някой специфичен праймер / сонди за 2019-nCoV показва крива на растеж, която пресича праговата линия, се интерпретира както следва:

    • Възможно е да има замърсяване на реагенти за екстракция на нуклеинова киселина. Недействителен цикъл и потвърдете целостта на реагента на реагенти за екстракция на нуклеинова киселина преди по-нататъшно тестване.
    • Кръстосано замърсяване на пробите е станало по време на процедурите за извличане на нуклеинова киселина или настройка на анализа. Невалиден цикъл и повторете анализа с по-строго спазване на указанията на процедурата.
• Когато всички контроли показват очакваната ефективност, образецът се счита за отрицателен, ако всички маркери за 2019-nCoV (N1, N2, N3) цикъл на праг на растеж на цикъла НЕ прекрачват прага, а кривата на растеж RNase P НЕ пресича праговата линия.
• Когато всички контроли показват очакваната ефективност, образецът се счита за положителен за 2019-nCoV, ако всички маркери (N1, N2, N3) кривата на растеж на праговата крива на цикъла пресече праговата линия. RNase P може или не може да бъде положителен, както е описано по-горе, но резултатът 2019-nCoV все още е валиден.
• Когато всички контроли показват очакваната ефективност и кривите на растеж за 2019-nCoV маркерите (N1, N2, N3) И RNase P маркер НЕ пресичат кривата на растеж на праговия цикъл, резултатът е невалиден. Екстрахираната РНК от пробата трябва да бъде повторно тествана. Ако остатъчната РНК не е налична, извлечете отново РНК от остатъчния образец и повторно тествайте. Ако повторно тестваната проба е отрицателна за всички маркери и всички контроли показват очакваната ефективност, резултатът е „Невалиден“.
• Когато всички контроли показват очакваната ефективност и кривата на растеж на праговия цикъл за всеки един или два маркера (N1, N2, N3), но не и трите преминават граничната линия, резултатът е неубедителен за 2019-nCoV. Повторно извличане на РНК от остатъчен образец и повторно тестване.

2019-nCoV rRT-PCR Интерпретация на резултатите от диагностичния панел

2019-nCoV rRT-PCR Интерпретация на резултатите от диагностичния панел

2019 nCoV_N1	2019 nCoV_N2	2019 nCoV_N3	RP	Тълкуване на резултатите
+	+	+	±	2019-nCoV е открит
Ако само една или две, от три цели е положителна			±	Неубедителен резултат
-	-	-	+	2019-nCoV не е открит
-	-	-	-	Невалиден резултат

Ограничения за анализ

• Анализаторите трябва да бъдат обучени и запознати с процедурите за тестване и интерпретация на резултатите преди извършване на анализа.
• Лъжлив отрицателен резултат може да възникне, ако в екземпляра има недостатъчен брой организми поради неправилно събиране, транспортиране или манипулиране.
• По-специално РНК вирусите показват значителна генетична вариабилност. Въпреки че бяха положени усилия за проектиране на rRT-PCR анализи за запазени области на вирусни геноми, променливостта, водеща до несъответствия между праймерите и пробите и целевите последователности, може да доведе до намалена ефективност на анализа и възможни фалшиво отрицателни резултати.