- Алтернативни многослойни секвениращи пишещи грундове за S. pneumoniae
- PCR в реално време Идентификация на S. pneumoniae
- PCR в реално време приспадане на пневмококови серотипове или серогрупи
- Конвенционална PCR дедукция на 40 пневмококови серотипа или серогрупи
- Конвенционални протоколи за приспадане на PCR серотип
- Мултиплексни конвенционални PCR схеми за извличане на пневмококов серотип
- Пневмококови протоколи за превоз
Ресурсите, свързани с идентифицирането на Streptococcus pneumoniae и нейните серотипове или серогрупи (малки групи от силно свързани серотипове, например 9A / 9V), са по-долу.
Алтернативни многослойни секвениращи пишещи грундове за S. pneumoniae
Алтернативните мултилокови секвениращи типиращи праймери (MLST) са разположени на около 40 бази нагоре по течението на други праймери, документирани за пневмококов MLST. Можете да използвате тези праймери за получаване на първите няколко основи на целевата последователност.
S. pneumoniae алтернативни MLST праймери:
aroE-fwd TCCTATTAAGCATTCTATTTCTCCCTTC
aroE-rev ACAGGAGAGGATTGGCCATCCATGCCCACACTG
recA-fwd GAATGTGTGATTCAATAATCACCTCAAATAGAAGG
recA-rev TGCTGTTTCGATAGCAGCATGGATGGCTTCC
spi-fwd CGCTTAGAAAGGTAAGTTATGAATTT
spi-rev GAAGAGGCTGAGATTGGTGATTCTCGGCC
xpt-fwd TTAACTTTAGAGTTAGGAGGTCTTATG
xpt-rev CGGCTGCTTGCGAGTGTTTTTCTTGGAG
ddl-fwd TAAAATCACGACTAAGCGTGTTCTGG
ddl-rev AAGTAGTGGGTACATAGACCACTGGG
PCR в реално време Идентификация на S. pneumoniae
Можете да постигнете PCR откриване на S. pneumoniae чрез усилване на lytA генната цел. Подробности за PCR в реално време:
- PCR анализи в реално време Cdc-pdf [1 страница] (Актуализирано февруари 2017 г.)
- откриване на пневмонииCdc-excel (Актуализирано февруари 2017 г.)
PCR в реално време приспадане на пневмококови серотипове или серогрупи
Понастоящем са налични двадесет и един моноплексни PCR тестове в реално време за откриване на пневмококови серотипове или серогрупи. Списък на праймери / проби и серотипи / групи, обхванати в наличните по-долу анализи.
PCR-серотипиращи олигонуклеотиди в реално време Cdc-pdf [2 страници]
Подобно на конвенционалното PCR серотипизиране, за PCR анализи в реално време са достъпни специфични схеми въз основа на географското разпространение на серотипите. Анализите се мултиплексират в последователен триплекс формат, наличен по-долу, разделен по географска област.
- Triplex последователно PCR-серотипиране в Латинска Америка Cdc-pdf в реално време [4 страници]
- Триплексна последователна PCR-серотипизация в реално време-US Cdc-pdf [4 страници]
- Triplex последователна PCR-серотипизация в реално време Африка Cdc-pdf [4 страници]
- Triplex последователно PCR-серотипизиране на Азия Cdc-pdf [4 страници]
Конвенционална PCR дедукция на 40 пневмококови серотипа или серогрупи
Точното серотипизиране е от съществено значение за епидемиологичното изследване на S. pneumoniae. CDC създаде прости мултиплексни PCR схеми за надеждно извличане на специфични пневмококови серотипове от изолатни групи и клинични проби. Този PCR подход е много надежден и има потенциал да намали зависимостта от конвенционалното фенотипично серотипизиране. Тази система дава потенциал за определяне на серотипа на всяко съоръжение, което разполага с оборудване, необходимо за амплификация на ДНК и електрофореза; не е нужно да пишете серуми или други реагенти.
По-долу са описани протоколи, в които подробно се описват методите за извличане на ДНК от бактериални изолати и клинични проби за всякакъв вид PCR тестване:
- Бързо извличане на ДНК за изолати от стрептококови култури Cdc-pdf [1 страница]
- Извличане на ДНК от кръв и телесна течност за стрептококи Cdc-pdf [2 страници]
Конвенционални протоколи за приспадане на PCR серотип
CDC валидира и прецизира грундиращите комплекти старателно чрез разнообразни изолатни набори, представляващи отделни серотипове. Добавят се сероспецифичности и се актуализират наборите от грундове, за да се подобрява редовно специфичността. По-долу е наличен актуализиран списък на праймерите (41 сероспецифичности).
Олигонуклеотидни грундове, използвани за извеждане 41 Пневмококови капсулни серотипове Cdc-pdf [3 страници]
Има 3 важни точки за използването на тази PCR схема на серотипизиране:
- Размерите на лентите трябва точно да съответстват на положителните контроли, преди да се назначи серотип. Понякога се откриват неспецифични ленти при извършване на мултиплексно PCR тестване на клинични проби.
- Отрицателната cpsA контрола не е непременно равна на несеротипизируем изолат или пневмокок-отрицателен клиничен образец. Положителната пневмококова контролна лента за cpsA е отрицателна в 1-2% от PCR-серотипируеми изолати, които са били срещани. Този резултат най-често се среща при серотипове 25 и 38, но рядко се среща при серотипове 14 и 35А.
-
Използването на този PCR анализ в превозни образци може да доведе до известна неточност в зависимост от пробата и популацията на превоз. Установени са големи количества на амплификация на някои предполагаеми пневмококови специфични мишени за серотипиране от лита А-негативни образци (т.е. предполага се, че не съдържат пневмококи). Например, шестте последователност от 192 bp директно отдолу съответстват на продуктите за амплификация на пневмококова серогрупа 10F / 10C (след изваждане на праймери).
> Seq1 [организъм = Streptococcus infantis] [щам SS1641] wzx ген, частичен CDS
TAGAATATGCTAGGCATCATTTGAAACCTGTCATCTTATTGTTCCTTCCGCAAGTGGCGA
TTTCCTTGTATGTAACGCTAGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGGATTTATGACCAGGCTCTAAAGTTGGTAAATATCCTTCTGACCTTAGTAACTTCCT
TGGGAAGTGTTA
> Seq2 [организъм = Streptococcus gordonii] [щам SS1245] wzx ген, частичен CDS
TAGAATATGCTAGGCATCATTTAAAGCCGGTCATATTATTATTCCTTCCTCAAGTAGCTA
TTTCTTTGTACATTACGCTGGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGAATTTATGACCAGGCCCTAAAATTAGTAAATATCCTTCTGACCTTAGTAACTTCCT
TGGGAAGCGTTA
> Seq3 [организъм = Streptococcus salivarius] [щам SS1061] wzx ген частичен CDS
TAGAATATGCTAGGTATCATTTAAAGCCAGTCATATTATTATTCCTTCCTCAAGTAGCTA
TTTCTTTGTACATTACGCTGGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGGATTTATGACCAGGCCTTAAAATTAGTAAATATCCTTCTGACCTTGGTAACTTCCT
TGGGAAGCGTTA
> Seq4 [организъм = неизвестен] [проба на горните дихателни пътища на човека 49] wzx ген, частичен CDS
TAGAATATGCTAGACATCATTTAAAGCCGGTCATATTATTATTCCTTCCTCAAGTAGCTA
TTTCTTTATACATTACGCTGGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGGATTTATGACCAGGCCCTAAAATTAGTAAATATCCTTCTGACCTTGGTAACTTCCT
TGGGAAGCGTTA
> Seq5 [организъм = неизвестен] [проба на горните дихателни пътища на човека 248] wzx ген, частичен CDS
TAGAATATGCTAGACATCATTTAAAGCCGGTCATATTATTATTCCTTCCTCAAGTAGCTA
TTTCTTTGTACATTACGCTGGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGGATTTATGACCAGGCCCTAAAATTAGTAAATATCCTTCTGACCTTGGTAACTTCCT
TGGGAAGCGTTA
> Seq6 [организъм = неизвестен] [човешки горен дихателен тракт 300] wzx ген, частичен CDS
TAGAATATGCTAGACATCATTTAAAGCCGGTCATATTATTATTCCTTCCTCAAGTAGCTA
TTTCTTTGTACATTACGCTGGATCGTACCATGCTTGGAGCCTTAGCTTCTACAAAAGATG
TAGGAATTTATGACCAGGCTCTAAAATTGGTAAATATCCTTCTGACCTTGGTAACTTCCT
TGGGAAGCGTTA
Тези последователности са открити при непневмококови видове и / или лита А-негативни образци за превоз. Допълнителните данни от образци на горните дихателни пътища демонстрират непневмококови хомолози на допълнителни серогрупи и серотипове. 1, 2
Мултиплексни конвенционални PCR схеми за извличане на пневмококов серотип
Следващата последователна PCR схема, базирана на географско разпределение на серотипа, е полезна за определяне на пневмококови серотипове в мултиплекс формат. Уверете се, че размерите на лентите точно съвпадат с положителните контроли, преди да зададете серотип. Понякога са открити неспецифични ленти при използване на множествен PCR за тестване на клинични проби.
- Американска схема Cdc-pdf [5 страници]
- Схема на Латинска Америка Cdc-pdf [5 страници]
- Африка схема Cdc-pdf [5 страници]
Пневмококови протоколи за превоз
По-долу са дадени подробни протоколи за събиране, обработка и съхранение на проби за назофарингеални тампони за пневмококови превози.
- Идентифициране и серотипизиране на пневмококи от карета Cdc-pdf [1 страница]
- Streptococcus pneumoniae Протокол за изследване на превоза - Обработка на носоглътката (NP) Cdc-pdf [3 страници]
Бележки под линия
1Carvalho MG, Bigogo GM, Junghae M, et al. Потенциално непневмококово смущение на PCR-базираното определяне на серотипа при превоз Външно. J Clin Microbiol. 2012; 50 (9): 3146-7.
